- HOME/
- 受賞者インタビュー /
- 花岡健二郎先生インタビュー［後編］
助成受賞者インタビュー特集
技術開発研究助成
受賞者インタビュー
花岡健二郎先生インタビュー［後編］
新たな近赤外蛍光団の開発を基盤とした創薬指向型蛍光プローブの創製
蛍光イメージング技術の最新研究成果
2008年に下村脩先生が「緑色蛍光タンパク質（GFP）」の発見でノーベル化学賞を受賞するなど、近年、生体内の特定分子を蛍光色素で光らせて可視化する「蛍光イメージング」は生命科学の研究に欠かせない医工計測技術となっている。中谷財団の2021年度特別研究助成を受けた慶應義塾大学の花岡健二郎先生は、そんな蛍光イメージング研究における世界的なトップランナーのひとりである。2年にわたる助成期間の初年度を終えた花岡先生に、最新の研究成果について教えていただいた。
令和3年度
技術開発研究助成 特別研究
- 氏名
- 花岡健二郎教授
- 所属機関・職名
- 慶應義塾大学薬学部・大学院薬学研究科 創薬分析化学講座
- 主な受賞歴
- 第3回 島津奨励賞（2020年度）、平成25年度 中谷賞 奨励賞 他多数
オリジナルの技術を強みに研究をリード
花岡先生が研究しているのは、特定の分子と反応して蛍光の強さや波長が変わる「蛍光プローブ」という機能性分子だ。1980年代にアメリカで開発された、カルシウムイオン（Ca2+）に反応するカルシウムイオン蛍光プローブが最初とされ、花岡先生は「そのCa2+は電子顕微鏡でも見るのが難しい極小の原子ですが、光らせることで簡便に視覚化できますし、生きた状態の生体分子の動態をリアルタイムで見ることができます」と有用性を説明する。
その後、1990年代～2000年代にかけて、蛍光顕微鏡の性能向上やGFPのノーベル賞受賞などを機に蛍光イメージング技術に注目が集まると、世界中の研究室が続々と蛍光プローブ開発に参入してきた。こうして競争は激しくなったものの、花岡先生が「核となるオリジナルの技術を持たないラボが研究を続けていくのは、なかなか難しいようです」と話すように、この十余年で自然淘汰が進んだ。
その後、1990年代～2000年代にかけて、蛍光顕微鏡の性能向上やGFPのノーベル賞受賞などを機に蛍光イメージング技術に注目が集まると、世界中の研究室が続々と蛍光プローブ開発に参入してきた。こうして競争は激しくなったものの、花岡先生が「核となるオリジナルの技術を持たないラボが研究を続けていくのは、なかなか難しいようです」と話すように、この十余年で自然淘汰が進んだ。
花岡先生
その点で、花岡先生の研究室はオリジナル技術として、前回のインタビューでも伺った「Si（ケイ素／シリコン）置換ローダミン（シリコンローダミン＝SiR）類」や、その分子構造を左右非対称にした「非対称型SiR類」など「近赤外蛍光団」の分子設計技術を有する。近赤外領域の光は生体組織への透過性が高く、自家蛍光やGFPの波長領域とも被らない。花岡先生のチームは、こうしたメリットのある蛍光プローブの開発技術を強みとして、研究をリードしている。
2021度特別研究助成でも、これらの分子設計手法を中核技術とした、以下の3つの蛍光プローブ開発が研究目標として掲げられた。
①リソソーム内pHを定量可能な蛍光プローブの開発
②プロテアーゼ活性を検出する近赤外蛍光プローブの開発
③HaloTag®タンパク質を蛍光標識するoff/on型蛍光プローブの開発
このうち、すでに②と③は2022年中に論文化され、それぞれ、②は英国RSC（王立化学会）の『RSC Chemical Biology』(RSC Chem. Biol.3, 859 (2022))、③は米国化学会の『Journal of the American Chemical Society（JACS）』(J. Am. Chem. Soc. 144, 19778 (2022))という、ともに権威ある学術雑誌に掲載された。
RSC Chem. Biol. 3, 859 (2022)
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/cb/d1cb00253h
J. Am. Chem. Soc. 144, 19778 (2022)
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c06397
①リソソーム内pHを定量可能な蛍光プローブの開発
②プロテアーゼ活性を検出する近赤外蛍光プローブの開発
③HaloTag®タンパク質を蛍光標識するoff/on型蛍光プローブの開発
このうち、すでに②と③は2022年中に論文化され、それぞれ、②は英国RSC（王立化学会）の『RSC Chemical Biology』(RSC Chem. Biol.3, 859 (2022))、③は米国化学会の『Journal of the American Chemical Society（JACS）』(J. Am. Chem. Soc. 144, 19778 (2022))という、ともに権威ある学術雑誌に掲載された。
RSC Chem. Biol. 3, 859 (2022)
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/cb/d1cb00253h
J. Am. Chem. Soc. 144, 19778 (2022)
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c06397
酵素活性を検出する汎用性の高い設計手法
②の「プロテアーゼ活性を検出する近赤外蛍光プローブの開発」のきっかけに関して、花岡先生は次のように話す。
「蛍光プローブは計算化学を使って狙いどおりのものを理論的に作っていくのですが、なかには『作ってみたらおもしろそうなものができた』という場合もあります。プロテアーゼ活性を検出する近赤外蛍光プローブの開発は、まさにそれがスタートとなりました」
その「おもしろそうなもの」とは、プロテアーゼ（加水分解酵素）の基質（分解の対象となる物質）となるアミノ酸をくっつけることで、光の吸収波長が大幅に短くなるSiR（シリコンローダミン）類だ。この蛍光プローブを用いると、特定の酵素が活性化している場合はくっつけたアミノ酸が分解されて吸収波長が元に戻る（長波長化する）とともに、蛍光強度は大きく上昇する。
研究では、2型糖尿病の創薬標的分子や、食道がん検出のバイオマーカーとしても注目されるDPP-4（ジペプチジルペプチダーゼ4）という酵素をターゲットとした蛍光プローブを開発し、「食道がんの部位で蛍光が上昇し、DPP-4の阻害剤を加えると蛍光が下がる様子が確認できました」（花岡先生）という結果が得られた。
「蛍光プローブは計算化学を使って狙いどおりのものを理論的に作っていくのですが、なかには『作ってみたらおもしろそうなものができた』という場合もあります。プロテアーゼ活性を検出する近赤外蛍光プローブの開発は、まさにそれがスタートとなりました」
その「おもしろそうなもの」とは、プロテアーゼ（加水分解酵素）の基質（分解の対象となる物質）となるアミノ酸をくっつけることで、光の吸収波長が大幅に短くなるSiR（シリコンローダミン）類だ。この蛍光プローブを用いると、特定の酵素が活性化している場合はくっつけたアミノ酸が分解されて吸収波長が元に戻る（長波長化する）とともに、蛍光強度は大きく上昇する。
研究では、2型糖尿病の創薬標的分子や、食道がん検出のバイオマーカーとしても注目されるDPP-4（ジペプチジルペプチダーゼ4）という酵素をターゲットとした蛍光プローブを開発し、「食道がんの部位で蛍光が上昇し、DPP-4の阻害剤を加えると蛍光が下がる様子が確認できました」（花岡先生）という結果が得られた。
花岡先生は「現在、食道がんの内視鏡治療では染色にポピドンヨードが使われていますが、ポピドンヨードにはアレルギーをもつ人もいるので、将来的にこのような蛍光プローブが使用される可能性はあるのではと考えています」と展望する。
また、「今回の研究はプローブの基礎設計手法の開発ですので、DPP-4以外の酵素活性を見たい場合は、SiR類にくっつける基質を酵素に合わせて変えてあげればよいのです」（花岡先生）というように、汎用性の高い分子設計手法となっている。
つまり、病態によって高発現する酵素に合わせた蛍光プローブを作ることで、さまざまな病気に応用できる可能性を秘めている。
また、「今回の研究はプローブの基礎設計手法の開発ですので、DPP-4以外の酵素活性を見たい場合は、SiR類にくっつける基質を酵素に合わせて変えてあげればよいのです」（花岡先生）というように、汎用性の高い分子設計手法となっている。
つまり、病態によって高発現する酵素に合わせた蛍光プローブを作ることで、さまざまな病気に応用できる可能性を秘めている。
図1
端緒は「長年放置されてきた疑問の解明」
一方、③の「HaloTag®タンパク質を蛍光標識するoff/on型蛍光プローブの開発」は、酵素の活性を見る②の蛍光プローブに対して、生体内のタンパク質を見るための蛍光プローブ設計手法である。
その端緒となったのは、「長年放置されてきた疑問の解明」だった。
ローダミン類は1世紀以上前から用いられてきた蛍光色素だが、ローダミン類と分子構造が酷似するフェニルローダミン類はなぜか蛍光を発しない。
花岡先生は「これは広く知られていましたが、なぜ無蛍光性なのかはわかっていませんでした。そこで、そのメカニズムを解明することにしたのです」という。
その端緒となったのは、「長年放置されてきた疑問の解明」だった。
ローダミン類は1世紀以上前から用いられてきた蛍光色素だが、ローダミン類と分子構造が酷似するフェニルローダミン類はなぜか蛍光を発しない。
花岡先生は「これは広く知られていましたが、なぜ無蛍光性なのかはわかっていませんでした。そこで、そのメカニズムを解明することにしたのです」という。
図2
蛍光分子は、光をあてることで高エネルギーの「励起状態」となり、光をあてるのをやめて分子が元の「基底状態」に戻るときに、エネルギーを蛍光として放出する。しかし、分子軌道計算などを用いた根気強い実証の結果、フェニルローダミン類に光をあてると、分子構造の一部（キサンテン環‐N原子間）の結合が90度ねじれる「ねじれ型分子内電荷移動（Twisted intramolecular charge transfer：TICT）」といわれる状態になることが判明。これが蛍光を発さない原因であることがわかった。
そこで、「このねじれを抑制すれば、フェニルローダミン類も蛍光を発するようになるのではないか」と考えた花岡先生は、タグタンパク質として広く用いられているHaloTag®に着目。フェニルローダミン類にリガンド（タグタンパク質と結合する物質）をつけ、HaloTag®を結合させることで立体障害を起こす。これによってねじれを抑制し、蛍光を発するようにした。
こうして確立した新たな蛍光プローブの分子設計法について、花岡先生は「小さい分子（小分子）でありながら、特定のタンパク質を捉えて蛍光がOFFからONに変わる、しかも近赤外光領域の蛍光プローブはこれまでにあまり存在しませんでしたので、これを理論的に作れるようになったことの意義は大きいと思います」と話す。
こうして確立した新たな蛍光プローブの分子設計法について、花岡先生は「小さい分子（小分子）でありながら、特定のタンパク質を捉えて蛍光がOFFからONに変わる、しかも近赤外光領域の蛍光プローブはこれまでにあまり存在しませんでしたので、これを理論的に作れるようになったことの意義は大きいと思います」と話す。
具体的な使い方としては、観察したいタンパク質とHaloTag®を融合させ、そこにHaloTag®用のリガンドをつけた蛍光プローブを入れることでタンパク質を光らせる。
花岡先生は「こういう場合はGFPを用いるのが主流ですが、GFPと同じように使えるタグタンパク質を作り、後から蛍光色素を加えるということが可能になります。しかも、近赤外光領域まで色調を選ぶことができるのです」と利点を説明する。
ちなみに、RFP（赤色蛍光タンパク質）など蛍光タンパク質にも様々な波長（色調）のものが開発されているが、緑色以外は安定性や蛍光の強さなどでまだ十分といえるものの数が少ない。そのため「赤色や近赤外では、我々の有機色素を使った蛍光プローブの方がアプリケーションとして優れている、という評価を多くいただいています」（花岡先生）と言う。
花岡先生は「こういう場合はGFPを用いるのが主流ですが、GFPと同じように使えるタグタンパク質を作り、後から蛍光色素を加えるということが可能になります。しかも、近赤外光領域まで色調を選ぶことができるのです」と利点を説明する。
ちなみに、RFP（赤色蛍光タンパク質）など蛍光タンパク質にも様々な波長（色調）のものが開発されているが、緑色以外は安定性や蛍光の強さなどでまだ十分といえるものの数が少ない。そのため「赤色や近赤外では、我々の有機色素を使った蛍光プローブの方がアプリケーションとして優れている、という評価を多くいただいています」（花岡先生）と言う。
図3
研究では、培養細胞の細胞膜上で発現するタグタンパク質をリアルタイムで蛍光イメージングしたほか、組織透明化技術という最新技術と組み合わせることで、マウス脳の神経細胞におけるHaloTag®タンパク質の発現を可視化することにも成功している。将来的には、病態によって高発現するタンパク質と結合する蛍光プローブを開発し、内視鏡検査や手術中に病巣を蛍光検出して、診断や治療に役立てることなどが期待される。
研究はスタート時の決意が最大の難関
こうして、助成期間の1年目で3つの研究目標のうち2つはスムーズに達成した花岡先生のチームだが、研究現場では様々な苦労があった。なかでも難しいうえに重要なのが「何に着目して研究を始めるか」だという。
花岡先生
花岡先生は「たとえば、②のプロテアーゼ活性を検出するプローブの場合、たくさん色素を作ったなかで『これ、おもしろそうだ』というものを見つけたことが発端となりましたが、その『おもしろそう』なものにしっかりと目を向けられるか、着目して研究をスタートできるかどうか、それを決意することが最も重要だったと思います」と振り返る。
③のHaloTag®タンパク質を蛍光標識するプローブの場合も、「フェニルローダミン類の無蛍光性」という、「私たちの分野ではよく知られていた疑問ですが、その解明に踏み込むのかどうかの決意が、最大の難関」（花岡先生）だったという。実際の研究は博士課程の院生などと進めるが、彼らにとって純粋にアカデミックな興味だけで研究テーマを決めるのはなかなかハードルが高い。学位のかかった院生には、前例がなく、先の見えにくい研究はリスクとなるからだ。花岡先生は、「だから、院生がやる気を出してくれるかどうかも、難点のひとつかもしれません」と笑う。
③のHaloTag®タンパク質を蛍光標識するプローブの場合も、「フェニルローダミン類の無蛍光性」という、「私たちの分野ではよく知られていた疑問ですが、その解明に踏み込むのかどうかの決意が、最大の難関」（花岡先生）だったという。実際の研究は博士課程の院生などと進めるが、彼らにとって純粋にアカデミックな興味だけで研究テーマを決めるのはなかなかハードルが高い。学位のかかった院生には、前例がなく、先の見えにくい研究はリスクとなるからだ。花岡先生は、「だから、院生がやる気を出してくれるかどうかも、難点のひとつかもしれません」と笑う。
さらに、前例のないテーマの場合、研究の進め方を一から決めなければならないことも難点のひとつだ。たとえば、「マグネシウムイオンや亜鉛イオンの蛍光プローブを作る場合、すでにカルシウムイオン蛍光プローブの前例があるので、それぞれのイオンにくっつく構造を組み込んで滴定曲線を書いて……といった手順がある程度決まってきます。でも、今回目標とした研究はどれも前例のないものなので、『まずは何から進めようか』というところからスタートしなければなりませんでした」と花岡先生は言う。
そうした研究の進め方では、自分の専門分野だけではなく、周辺の最新技術動向を知っておくことも重要だという。花岡先生は「現在は、一つの分野だけを極めれば研究が完結するという時代ではありません。たとえば、10年前と比べればHaloTag®などもかなり性能が向上しているので、それを知っていなければHaloTag®タンパク質を蛍光標識するプローブの開発も進んでいなかったでしょう」と話す。
そうした研究の進め方では、自分の専門分野だけではなく、周辺の最新技術動向を知っておくことも重要だという。花岡先生は「現在は、一つの分野だけを極めれば研究が完結するという時代ではありません。たとえば、10年前と比べればHaloTag®などもかなり性能が向上しているので、それを知っていなければHaloTag®タンパク質を蛍光標識するプローブの開発も進んでいなかったでしょう」と話す。
自由度の高い助成が研究を後押し
専門分野はもちろん、広く周辺分野まで知見を広げておくことの重要性は、研究の進め方にとどまらない。
花岡先生は「フェニルローダミン類の無蛍光性の解明のように、『うまくいくかどうかわからないけど面白そうな研究』という“手持ちのネタ”を常に3～4つは持っているのですが、そういうネタも様々な学会や論文から仕入れることが多いです」と話す。
その他にも、たとえば近赤外光領域よりもさらに長波長化した蛍光団の開発など、常に頭の片隅に置いている課題があって、様々な学会でヒントになるようなものを見つけては試す、ということを繰り返しているという。
花岡先生は「フェニルローダミン類の無蛍光性の解明のように、『うまくいくかどうかわからないけど面白そうな研究』という“手持ちのネタ”を常に3～4つは持っているのですが、そういうネタも様々な学会や論文から仕入れることが多いです」と話す。
その他にも、たとえば近赤外光領域よりもさらに長波長化した蛍光団の開発など、常に頭の片隅に置いている課題があって、様々な学会でヒントになるようなものを見つけては試す、ということを繰り返しているという。
花岡先生
そんななかからいくつかのアイデアは浮かぶものの、実際に作るとなると難しいことが多い。
「そういう場合、ポスドク（博士研究員）などが片手間に調べてくれたりするといい結果が出ることも多いんです」と花岡先生は話す。
「私たちのころは『ヤミ実験』なんてよんでいたのですが、教授に黙ったまま実験をして、いいスペクトル（波長）を示すものができたら報告する、というようなことをやっていました（笑）。そんなふうに、常に『何か思いがけないことが起きるんじゃないかな』と期待しながら行った実験が、いい研究につながることが多いような気がします」（花岡先生）と言う。
「そういう場合、ポスドク（博士研究員）などが片手間に調べてくれたりするといい結果が出ることも多いんです」と花岡先生は話す。
「私たちのころは『ヤミ実験』なんてよんでいたのですが、教授に黙ったまま実験をして、いいスペクトル（波長）を示すものができたら報告する、というようなことをやっていました（笑）。そんなふうに、常に『何か思いがけないことが起きるんじゃないかな』と期待しながら行った実験が、いい研究につながることが多いような気がします」（花岡先生）と言う。
そのためにも、研究室のスタッフの充実は重要だ。花岡先生は「その点に関しては、中谷財団さんの助成はとてもありがたいです。金額の多さもさることながら、使い道の自由度が高く、人件費に使ってもいいとのことでしたので、おかげでポスドクスタッフを増やすことができました」と感謝する。
充実したチームで挑む2年目には、研究目標①の「リソソーム内pHを定量可能な蛍光プローブの開発」に挑むが、「すでにプロトタイプは完成しています」（花岡先生）とのこと。2年目の成果にも大いに期待したい。
充実したチームで挑む2年目には、研究目標①の「リソソーム内pHを定量可能な蛍光プローブの開発」に挑むが、「すでにプロトタイプは完成しています」（花岡先生）とのこと。2年目の成果にも大いに期待したい。